La espectroscopía de RMN de Carbohidratos es la aplicación de la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) al análisis estructural y conformacional de carbohidratos. Este método permite a los científicos dilucidar la estructura de los monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, glicoconjugados.y otros derivados de carbohidratos de fuentes sintéticas y naturales.
Entre las propiedades estructurales que podrían determinarse mediante RMN se encuentran la estructura primaria (incluida la estereoquímica), la conformación de sacárido, la estequiometría de los sustituyentes y la proporción de sacáridos individuales en una mezcla. Los modernos instrumentos de RMN de alto campo utilizados para muestras de carbohidratos, típicamente de 500 MHz o más, pueden ejecutar un conjunto de experimentos 1D, 2D y 3D para determinar una estructura de compuestos de carbohidratos.
RMN de carbohidratos
Cambio químico
Los rangos de desplazamiento químico comunes para los núcleos dentro de los residuos de carbohidratos son:
Los desplazamientos químicos típicos de 1 H NMR de los protones del anillo de carbohidratos son de 3 a 6 ppm (4,5 a 5,5 ppm para los protones anoméricos).
Los cambios químicos típicos de 13 C NMR de los carbohidratos del anillo de carbohidratos son 60-110 ppm
En el caso de las moléculas simples de mono y oligosacáridos, todas las señales de protones están típicamente separadas entre sí (generalmente a 500 MHz o mejores instrumentos de RMN) y pueden asignarse utilizando solo el espectro de RMN 1D solamente. Sin embargo, las moléculas más grandes exhiben una superposición significativa de la señal del protón, especialmente en la región no anomérica (3-4 ppm).
La RMN de carbono 13 supera esta desventaja con una mayor gama de cambios químicos y técnicas especiales que permiten bloquear el acoplamiento de espín carbono-protón, lo que hace que todas las señales de carbono se distingan entre sí.
Los rangos típicos de los cambios químicos específicos de carbono de carbohidratos en los monosacáridos no sustituidos son:
Carbones anoméricos: 90-100 ppm
Carbono en anillo de azúcar con función hidroxi: 68-77
Carbonos de azúcar de forma abierta que tienen una función hidroxi: 71-75
Carbones en el anillo de azúcar que tienen una función amino: 50-56
Grupos hidroximetilo exocíclicos: 60-64
Grupos carboxi exocíclicos: 172-176
Azúcar en anillo de azúcares desoxigenados: 31-40
Un carbono en el cierre del anillo de piranosa: 71-73 (anómeros α), 74-76 (anómeros β)
Un carbono en el cierre del anillo de furanosa: 80-83 (anómeros α), 83-86 (anómeros β)
Constantes de acoplamiento
Las constantes de acoplamiento directo carbono-protón se utilizan para estudiar la configuración anomérica de un azúcar. Las constantes de acoplamiento protón-protón vecinales se utilizan para estudiar la orientación estereofónica de los protones en relación con los otros protones dentro de un anillo de azúcar, identificando así un monosacárido.
Las constantes de acoplamiento de HCOC heteronucleares vecinales se utilizan para estudiar ángulos de torsión a lo largo del enlace glucosídico entre azúcares o a lo largo de fragmentos exocíclicos, revelando así una conformación molecular.
Los anillos de azúcar son fragmentos moleculares relativamente rígidos, por lo que los acoplamientos protón-protón vecinales son característicos:
Ecuatorial a axial: 1–4 Hz
Ecuatorial a ecuatorial: 0–2 Hz
Axial a axial no anomérico: 9–11 Hz
Axial a axial anomérico: 7–9 Hz
Hidroximetilo axial a exocíclico: 5 Hz, 2 Hz
Geminal entre protones hidroximetilos: 12 Hz
Efectos de sobrecarga nuclear (NOE)
Los NOE son sensibles a las distancias interatómicas, lo que permite su uso como sonda conformacional o prueba de la formación de un enlace Glucósido. Es una práctica común comparar los NOE de protón-protón calculados con los oligosacáridos experimentales para confirmar un mapa conformacional teórico.
El cálculo de NOEs implica una optimización de la geometría molecular.
Otros observables de RMN
Las relatividades, las tasas de relajación nuclear, la forma de la línea y otros parámetros se informaron útiles en estudios estructurales de carbohidratos.
Elucidación de la estructura de carbohidratos por espectroscopía de RMN
Parámetros estructurales de carbohidratos
La siguiente es una lista de características estructurales que se pueden dilucidar por RMN:
- Estructura química de cada residuo de Carbohidrato en una molécula, que incluye
- Tamaño del esqueleto de carbono y tipo de azúcar (aldosa / cetosa)
- Tamaño del ciclo (piranosa / furanosa / lineal)
- Configuración estéreo de todos los carbonos (identificación de monosacáridos)
- Configuración estereofónica de carbono anomérico (α / β)
- Configuración absoluta (D / L)
- Ubicación de amino, carboxi, desoxi y otras funciones
- Estructura química de los residuos no carbohidratos en la molécula (aminoácidos, Ácidos grasos, alcoholes, aglicones orgánicos, etc.)
- Posiciones de sustitución en residuos
- Secuencia de residuos
- Estequiometría de residuos terminales y cadenas laterales.
- Ubicación de los enlaces diéster de fosfato y sulfato
- Grado de polimerización y posicionamiento del marco (para polisacáridos)
Espectroscopía de RMN frente a otros métodos
Los métodos ampliamente conocidos de investigación estructural, como la espectrometría de masas y el análisis de rayos X, solo se aplican de forma limitada a los carbohidratos.Dichos estudios estructurales, como la determinación de secuencia o la identificación de nuevos monosacáridos, se benefician más de la espectroscopía de RMN.
La configuración absoluta y el grado de polimerización no siempre se pueden determinar utilizando solo RMN, por lo que el proceso de aclaración estructural puede requerir métodos adicionales. Aunque la composición monomérica se puede resolver mediante RMN, los métodos cromatográficos y de espectroscopía de masas proporcionan esta información a veces más fácil.
Las otras características estructurales enumeradas anteriormente pueden determinarse únicamente mediante los métodos espectroscópicos de RMN. La limitación de los estudios estructurales de RMN de carbohidratos es que la aclaración de la estructura difícilmente puede automatizarse y requiere un experto humano para derivar una estructura de los espectros de RMN.
Aplicación de diversas técnicas de RMN a los carbohidratos
Los glicanos complejos poseen una multitud de señales superpuestas, especialmente en un espectro de protones. Por lo tanto, es ventajoso utilizar experimentos 2D para la asignación de señales. La tabla y las figuras a continuación enumeran las técnicas de RMN más extendidas utilizadas en estudios de carbohidratos.
Esquema de investigación
La investigación espectroscópica de RMN incluye los siguientes pasos:
- Extracción de material de carbohidratos (para glicanos naturales)
- Eliminación química de restos que enmascaran la regularidad (para polímeros)
- Separación y purificación de material de carbohidratos (para experimentos de RMN 2D, se recomiendan 10 mg o más)
- Preparación de muestra (generalmente en D2O)
- Adquisición de espectros 1D
- Planificación, adquisición y procesamiento de otros experimentos de RMN (generalmente requiere de 5 a 20 horas)
- Asignación e interpretación de espectros (ver figura ejemplar)
- Si no se puede resolver un problema estructural: modificación / degradación química y análisis de productos por RMN
- Adquisición de espectros del compuesto nativo (sin máscara) y su interpretación basada en estructura modificada
- Presentación de resultados.
Bases de datos y herramientas de RMN de carbohidratos
Se han creado múltiples bases de datos de desplazamiento químico y servicios relacionados para ayudar a la aclaración estructural y el análisis experto de sus espectros de RMN. De ellos, varias herramientas informáticas están dedicadas exclusivamente a los carbohidratos:
- GlycoSCIENCES.de
- Más de 2000 espectros de RMN de glucanos de mamíferos
- Búsqueda de estructura por señales de RMN y viceversa
CSDB (base de datos de estructura de carbohidratos ) contiene:
- Más de 4000 espectros de RMN de glicanos bacterianos, vegetales y fúngicos,
- Búsqueda de estructura por señales de RMN y viceversa
- Rutina de simulación de espectros empíricos optimizada para carbohidratos,
- Estimación estadística del cambio químico basada en el algoritmo HOSE optimizado para carbohidratos,
- Herramienta de generación de estructura y clasificación basada en RMN.
CASPER (evaluación del espectro asistida por computadora de polisacáridos regulares). contiene:
Base de datos de cambio químico,
Rutina de simulación de espectros empíricos optimizada para carbohidratos,
Interfaz en línea
Herramienta de coincidencia de estructura. Los cambios químicos de protones y carbono C y H se pueden utilizar para acceder a información estructural.
Simulación de los observables de RMN
Se han revisado varios enfoques para simular RMN observables de carbohidratos. Incluyen:
Enfoques de bases de datos estadísticos universales (ACDLabs, Modgraph, etc.)
Uso de redes neuronales para refinar las predicciones.
Métodos basados en regresión
CARGAR
Esquemas empíricos optimizados para carbohidratos (CSDB / BIOPSEL, CASPER).
Cálculo combinado de geometría de dinámica / mecánica molecular y simulación / iteración de mecánica cuántica de observables de RMN (software de RMN PERCH)
Enfoques ONIOM (optimización de diferentes partes de la molécula con diferente precisión)
Ab initio cálculos.
El creciente poder computacional permite el uso de cálculos minuciosos de mecánica cuántica a altos niveles teóricos y grandes conjuntos de bases para refinar la geometría molecular de los carbohidratos y la posterior predicción de observables de RMN utilizando GIAO y otros métodos con o sin efecto de solvente.
Entre las combinaciones de nivel teórico y un conjunto de bases informadas como suficientes para las predicciones de RMN estaban B3LYP / 6-311G (2d, 2p) y PBE / PBE (ver revisión). Se demostró para los sacáridos que los esquemas empíricos optimizados con carbohidratos proporcionan una precisión significativamente mejor (0.0-0.5 ppm por 13Resonancia C) que los métodos químicos cuánticos (por encima de 2.0 ppm por resonancia) reportados como los mejores para las simulaciones de RMN, y funcionan miles de veces más rápido.
Sin embargo, estos métodos solo pueden predecir cambios químicos y un rendimiento pobre para las partes de moléculas que no son carbohidratos. Como ejemplo representativo, vea la figura a la derecha.