Los biosensores de glucosa fluorescentes son dispositivos que miden la concentración de glucosa en pacientes diabéticos por medio de una proteína sensible que transmite la concentración por medio de fluorescencia, una alternativa a la detección amperométrica de glucosa. Debido a la prevalencia de la diabetes, es el motor principal en la construcción de biosensores fluorescentes.
La FDA aprobó un desarrollo reciente que permite un nuevo sistema de monitoreo continuo de glucosa llamado EverSense, que es un monitor de glucosa de 90 días que utiliza biosensores fluorescentes.
Solicitud
Mantener los niveles de glucosa bajo control es crucial para minimizar la aparición del daño causado por la diabetes. Como consecuencia, junto con las administraciones de insulina, el principal requisito para los pacientes diabéticos es monitorear regularmente sus niveles de glucosa en sangre. Los sistemas de monitorización actualmente en uso general tienen el inconveniente de un número de lecturas por debajo del óptimo, debido a su dependencia de una gota de sangre fresca.
Algunos monitores continuos de glucosa están disponibles comercialmente, pero sufren el grave inconveniente de una corta vida útil de la sonda. La mayoría de estos funcionan amperométricamente. Como resultado, existe un esfuerzo por crear un sensor que dependa de un mecanismo diferente, como la espectroscopia infrarroja externa o los biosensores fluorescentes.
Existen varias estrategias para detectar los niveles de glucosa mediante fluorescencia, siendo la primera y la más común un ensayo de competencia de Fret entre la glucosa y un polímero de glucosa marcado para el sitio de unión de la concanavalina A. A lo largo de los años, utilizando una combinación de diseño racional y enfoques de detección, se han estudiado muchas combinaciones posibles de sensores fluorescentes para la glucosa con diversos grados de éxito:
En la mayoría de los enfoques, la concentración de glucosa se traduce en un cambio en la fluorescencia mediante el uso de un par de Fret o mediante el uso de colorantes sensibles al medio ambiente (solvatocrómicos) en una variedad de combinaciones, la molécula pequeña fluorescente, proteína o cuántica punto se han utilizado junto con un resto de unión a glucosa, ya sea un fluoróforo funcionalizado con ácido borónico o una proteína, como glucosa oxidasa, concanavalina A, proteína de unión a glucosa/galactosa, glucosa deshidrogenasa y glucoquinasa.
En general, el cambio observado con los ensayos de competición Fret es pequeño (ver más abajo).
Teoría de la fluorescencia
La fluorescencia es una propiedad presente en ciertas moléculas, llamadas fluoróforos, en las que emiten un fotón al poco tiempo de absorber uno con una longitud de onda de mayor energía.
Para ser más específicos, para que un electrón en el orbital externo de una molécula salte de un orbital en estado fundamental a un orbital en estado excitado, se requiere una cantidad fija de energía que, en el caso de los cromóforos (moléculas que absorben luz), puede adquirirse absorbiendo un fotón con una energía igual o ligeramente superior.
Este estado es de corta duración y el electrón vuelve al orbital a nivel del suelo, perdiendo la energía en forma de calor o, en el caso de los fluoróforos, emitiendo un fotón que, debido a la pérdida de la diferencia entre la energía del absorbido fotón y la energía de excitación requerida, tendrá una energía menor que el fotón absorbido, o, expresado en términos de longitud de onda, el fotón emitido tendrá una longitud de onda más larga.
La diferencia entre las dos longitudes de onda se llama desplazamiento de Stokes.
Esta propiedad se puede encontrar en puntos cuánticos, ciertos lantánidos y ciertas moléculas orgánicas con electrones deslocalizados.
Estas moléculas excitadas tienen un aumento en el impulso dipolar y, en algunos casos, pueden sufrir una reorganización de la carga interna. Cuando poseen un grupo atractor de electrones y un grupo donador de electrones en los extremos opuestos de la estructura de resonancia, tienen un gran cambio en la distribución de carga a lo largo de la molécula, lo que hace que las moléculas de solvente se reorienten a un arreglo menos energético, llamado relajación de solvente.
Al hacerlo, la energía del estado excitado disminuye y la magnitud de la diferencia de energía depende de la polaridad del solvente que rodea la molécula.
Un enfoque alternativo es utilizar tintes solvatocrómicos, que cambian sus propiedades (intensidad, vida media y espectros de excitación y emisión), dependiendo de la polaridad y la carga de sus entornos. Por lo tanto, a veces se los denomina tintes ambientalmente sensibles. Estos pueden colocarse en residuos específicos que cambian su disposición espacial debido a un cambio conformacional inducido por la glucosa o residen en el bolsillo de unión de la glucosa, por lo que el desplazamiento del agua presente por la glucosa disminuye la polaridad.
Una propiedad adicional de la fluorescencia que ha encontrado un gran uso es la transferencia de energía de resonancia de Förster ( Fret ) en la que la energía del electrón excitado de un fluoróforo, llamado donante, se transmite a un colorante aceptor cercano, ya sea un apagador oscuro ( cromóforo no emisor) u otro fluoróforo, que tiene un espectro de excitación que se superpone con el espectro de emisión del colorante donante, lo que da como resultado una fluorescencia reducida.
Para fines de detección, esta propiedad se usa, en general, en combinación con una biomolécula, como una proteína, que experimenta un cambio conformacional al unirse al ligando, cambiando la distancia entre las dos etiquetas en esta proteína, o en un ensayo de competencia. en el que el analito tiene que competir con una concentración conocida de un ligando marcado fijo por el sitio de unión marcado de la proteína.
Por lo tanto, el Fret entre el sitio de unión y el ligando competidor disminuye cuando aumenta la concentración de analito. En general, el ligando competidor en el caso de la glucosa es el dextrano, un polímero de glucosa largo unido al andamiaje oa la enzima.
Transferencia de energía de resonancia de Förster
A lo largo de los años, utilizando una combinación de diseño racional y procedimientos de detección, se han creado muchas tipologías posibles de sensores fluorescentes para glucosa con diversos grados de éxito. En general, estos sensores se basan en Fret o en la sensibilidad a los cambios de polaridad para traducir la concentración de glucosa en intensidad fluorescente.
Además de los fluoróforos, estos sensores contienen una molécula que confiere especificidad a la glucosa, normalmente una proteína. Se ha utilizado una variedad de proteínas para este propósito, a menudo con diferentes laboratorios concentrándose en una proteína en particular.
El primer biosensor de glucosa informado en la literatura fue fabricado en 1982 por el grupo de Schultz utilizando un ensayo de competencia de Fret entre la glucosa y un polímero de glucosa marcado para el sitio de unión de la concanavalina A atrapada en una fibra de diálisis hueca. Como resultado, Con A se usó ampliamente en sensores posteriores en varios laboratorios, sin embargo, Con A sufre la desventaja de una alta toxicidad.
Y baja reversibilidad. Como resultado, varios laboratorios exploraron y están explorando otras proteínas de unión a la glucosa.
En Biotex Inc. (Houston), McNichols y Ballastardt crearon un sensor ConA Fret encerrado en fibra de diálisis, que se ha sometido a pruebas en modelos animales durante varios años.
Los biosensores amperométricos, por el contrario, solo pueden utilizar glucosa oxidasa como proteína, ya que es una enzima redox. Esta proteína también se ha utilizado en la detección de fluorescencia, ya sea simplemente como apoenzima o como holoenzima. Una excepción a este grupo de sensores es el grupo de Biocapacitor A Sode, que en su lugar depende de la glucosa deshidrogenasa.
La actividad de la glucosa oxidasa también se ha utilizado para fabricar sensores fluorescentes/fosforescentes basados en la vida útil, aprovechando el hecho de que la proteína oxida la glucosa, utilizando oxígeno molecular, y que el oxígeno extingue la fluorescencia del rutenio. Esto fue hecho por Uwira y colegas en 1984 y seguido por varios grupos.
Para ser específicos, Endo y Pasic han utilizado este ensayo de extinción de oxígeno basado en GOx para fabricar un sensor basado en fibra, mientras que McShane utiliza el ensayo de extinción de oxígeno basado en GOx en microesferas fabricadas con el objetivo de inyección subcutánea. para crear lo que el grupo ha denominado «tatuaje inteligente», un sensor que funciona de forma no invasiva informando a través de la piel, aprovechando el hecho de que la piel es permeable a la luz infrarroja cercana.
Además, este grupo ha creado varios ensayos de finalización de Fret, primero usando ConA (TRITC-Con A /FITC-dextrano (500kDa)), pero luego cambió a la apoenzima GOx en 2004 (TRITC-apo-GOx /FITC-dextrano (500kDa)),y en 2009 probando sensores (QSY–apo-GOx/Alexa-dextrano) en microesferas. Varios otros grupos han construido tatuajes inteligentes y se revisan a continuación.
En un estudio realizado en el grupo de Ingo Klimant, se utilizó un ensayo particular de extinción de rutenio con oxígeno GOx en un sensor completamente funcional para medir los niveles de glucosa en un voluntario sano. El sensor se construyó funcionalizando un sensor de oxígeno con glucosa oxidasa e insertándolo en la parte externa de un catéter utilizado para el monitoreo.
Las apoenzimas aún pueden unirse a la glucosa pero, debido a la falta de cofactores (in vitro), no pueden catalizar su reacción, por lo que es menos probable que se dañen.
Otras proteínas que se han utilizado son la glucocinasa de un termófilo del grupo D’auria y la proteína de unión a glucosa-galactosa ( Ggbp ), que no es una enzima sino una proteína periplásmica implicada en la quimiotaxis que sufre una gran transformación conformacional. cambio.
La mayoría de los fluoróforos utilizados para los sensores son moléculas pequeñas, aunque algunos sensores se han fabricado utilizando puntos cuánticos (QD) o proteínas fluorescentes.
Los sensores se han fabricado utilizando QD como donantes de Fret y una pequeña molécula o nanopartícula de oro (apagador oscuro) como aceptores. Un ejemplo del primero es el sensil de Loeb, un sistema de fibra óptica en el que el punto cuántico se une a ConA mientras que la tetrametilrodamina se une al ciclodextrano, que a su vez se une al andamio de diacrilato de PEG.
Un ejemplo de esto último es Tang con QDs-ConA-beta-CDs-AuNPs.
La proteína fluorescente se puede convertir en una proteína de fusión con una proteína deseada, eludiendo los pasos de marcaje. Shultz hizo una molécula de Ggbp con dos GFP en cada extremo. No se ha informado en la literatura, pero en teoría es posible mejorar esto haciendo una evolución in vitro dirigida usando FACS.
Esto no se hace fácilmente mediante el etiquetado, aunque Pitner ha intentado una selección.
La fluorescencia no es el único tipo de luminiscencia que se puede lograr en los sistemas biológicos: la quimioluminiscencia, la generación de luz por medio de reacciones químicas, es producida por algunas proteínas, como la aqueorina del simbionte en las medusas y la luciferasa del simbionte en las luciérnagas.
Estos se han utilizado para hacer sensores de glucosa: Daunert hace un sensor de aqueorina dividida en Ggbp y en 2009 Koji Sode hizo Ggbp -luciferasa con AspAsn (Glc no Gal).
Además de los tintes de molécula pequeña, se han utilizado proteínas fluorescentes: un grupo fabricó un sensor de infrarrojo cercano (NIR) detectado mediante aloficocianina- ConA /verde de malaquita-dextrano de resolución temporal/nanotomografía, sobre Fret with Allophycocyanin, que MacColl ha revisado.
Además de la proteína como resto de unión a la glucosa, se han utilizado moléculas funcionalizadas con ácido borónico. El ácido borónico se une a grupos vecinales, preferiblemente hidroxilo; por lo tanto, tiene una alta afinidad por los carbohidratos. El uso del grupo del ácido borónico para el reconocimiento de sacáridos ha sido ampliamente estudiado por Shinkai, James y sus colaboradores.
Para aprovechar esto se han adoptado varios enfoques.
Un enfoque es mediante extinción de trastes, en el que el sistema puede funcionar a través de la modulación de la extinción de un tinte por un viológeno funcionalizado con ácido borónico.
Un enfoque alternativo es la transferencia de electrones fotoinducida (PET), un mecanismo de extinción de la fluorescencia debido al grupo amino terciario rico en electrones cerca del fluoróforo, que se ve afectado por el cambio en la carga del grupo boronato cercano cuando la glucosa se une.. Esto ha sido utilizado en combinación con la vida útil por un grupo., no solo en fluorescencia sino como agente de RMN para la obtención de imágenes con un tinte de ácido borónico de europio (3).
Tintes sensibles al medio ambiente
La mayoría de los sensores que adoptan colorantes ambientalmente sensibles han utilizado Ggbp, una proteína de transporte que se une a la D-glucosa y la D-galactosa y las transporta al receptor Trg unido a la membrana, lo que desencadena la quimiotaxis de la bacteria hacia esa fuente de glucosa. Pertenece a la familia malG en Escherichia coli, que incluye la proteína de unión a maltosa, que, dependiendo de la presencia de glucosa, puede adoptar dos conformaciones distintas o posiblemente tres generando un 31 º movimiento de bisagra entre los dos dominios globulares conectados por una bisagra, que es el bolsillo de unión a la glucosa.
Su afinidad por la glucosa es K= 0,2 μM,que es mucho más bajo que el rango fisiopatológico de glucosa que se encuentra en la diabetes (1.7-33 mM). Como consecuencia, se han realizado varios estudios para reducir la afinidad de Ggbp, que de lo contrario daría como resultado una saturación cercana de Ggbp a lo largo de las concentraciones fisiopatológicas de glucosa.
La afinidad de unión de Ggbp cambia cuando se marca endóstericamente o peristéricamente, por lo que se han creado varios mutantes que funcionan en un rango cercano a la glucosa fisiopatológica.
Ggbp contiene cinco residuos de triptófano, dos de los cuales, W183 en el sitio de unión y W284 en el dominio N-terminal (que puede unir calcio), afectan los espectros de autofluorescencia tras la unión de glucosa.
Algunos estudios con colorantes solvatocrómicos y Ggbp funcionan no para crear un sensor, sino para dilucidar la química detrás del cambio conformacional de Ggbp. Ejemplos de esto incluyen un estudio que utilizó L255C con acrilodán y rutenio en el extremo N que reveló tres estados conformacionales cerrados y retorcidos, la fluorescencia y fosforescencia del triptófano W183 en condiciones normales, bajo alta presión y con o sin calcio.
Sode et al. hizo una serie de mutantes de Ggbp para aumentar la Kd en la forma no marcada cerca del rango fisiológico (PheAla) y eliminar la especificidad de la galactosa (AspGlu).
La respuesta de un colorante sensible al entorno unido a un residuo específico de Ggbp depende no solo del sitio de marcaje, que tiene un entorno determinado, sino también de la naturaleza del colorante, que interactúa de forma diferente según su geometría. La interacción entre un tinte dado y su entorno es difícil de predecir in silico.
Como resultado, con el fin de obtener un sensor que funcione, varios estudios independientes examinaron un conjunto de colorantes ambientalmente sensibles adheridos a varios sitios posibles en el bolsillo de unión (sitio endotérico), cerca de él (sitio peristérico) o lejos de él (sitio alostérico). ).
Una ventaja de Ggbp es que en el tipo salvaje no hay residuos de cisteína, lo que hace que la introducción de este residuo en una ubicación específica sea ideal para el etiquetado.
Un equipo dirigido por Homme Hellinga realizó dos pantallas grandes. En el primero (2002) crearon una serie (320 construcciones) de mutantes marcados de 11 proteínas de unión periplásmicas bacterianas, incluida Ggbp, para las que crearon nueve mutantes introduciendo una cisteína en un punto específico (YC, N15C, E93C, E149C, H152C, W183C, L255C, D257C, V296C) y probó la respuesta cuando se marcó con uno de los ocho colorantes (pireno (340, 390);
Acrilodán (390, 500); fluoresceína (485, 520); NBD (490, 540); NBDE (490, 530); JPW (485, 590); JPW (470, 640); y JPW (470, 640)). De las 72 combinaciones realizadas, la Ggbp marcada con acrilodán en la posición W183C tuvo un cambio de cinco veces y kd= mM.
En un estudio posterior (2007), utilizando Ggbp termoestable de Thermotoga maritima, examinaron cinco mutantes (YC, W14C, Y189C, S131C y M239C) con cuatro colorantes ( Ianbd, Acrylodan, Cy y Cy) identificando el conjugado Y13C-Cy, lo que dio un aumento máximo del 50% y una afinidad a 15 mM.
Un grupo dirigido por Daunert usó tres mutantes endostéricos (GC, H152C y M182C) en combinación con cuatro colorantes (acrylodan, 1,5 -IAEDANS, MDCC y Ianbd éster) para identificar M182C–MDCC, lo que produjo un cambio del 30 % en la fluorescencia. Pitner adoptó un enfoque muy diferente en BD, quien usó un solo tinte ( Ianbd ) adjunto a E149C como punto de partida para una pantalla de evolución dirigida, en la que se crea una biblioteca mutante y se selecciona para «ganadores», a saber mutantes que cumplen los criterios de selección.
Con este enfoque, identificaron E149C/AR/LS con kd de 10 mM y un aumento de ocho veces en la fluorescencia; este mutante se usó más tarde para SPR.
Independientemente otro grupo (J Pickup) probó dos mutantes (HC y M182C) marcados con Badan (6-bromoacetil–dimetilaminonaftaleno), unido al grupo tiol de la cisteína introducida en el sitio 152 (mutante H152C). Esto mostró un aumento triple (cambio del 200%) al saturar la unión de glucosa, lo que lo convierte en un candidato ideal para un sensor.
Trabajos posteriores, adoptando las mutaciones identificadas por Pitner (arriba), generaron un mutante Ggbp marcado con Badan (HC/AR/LS), con una constante de disociación en el rango de glucosa fisiológica humana (Km= mM) y un aumento del doble en fluorescencia (100% de cambio).
Autofluorescencia tisular
Otro par de artículos sugieren que la fluorescencia natural (autofluorescencia) de los tejidos puede aprovecharse para rastrear las concentraciones de glucosa. Estos estudios aprovecharon el hecho de que NAD(P)H, en su forma reducida, es autofluorescente y que los metabolitos como la glucosa causan un aumento predecible en la reducción de NAD(P)H.
Detección en vivo
Una forma alternativa de medir el cambio en el entorno de los colorantes ambientales es su cambio en la vida útil, que puede dar mejores resultados en algunos sensores, utilizando lantánidos o, por ejemplo, el complejo de rutenio (Ru) metal-ligando mencionado anteriormente, ya sea con GOx o como un aceptor de Fret.
De un tinte sensible al medio ambiente como en el caso de ANS- Ggbp en una cubeta recubierta de rutenio que muestra un pequeño aumento en la intensidad pero un cambio sustancial en el tiempo de vida.
La construcción de la proteína fluorescente es solo un subsistema de un dispositivo de control clínicamente viable: la proteína sensora debe inmovilizarse y su fluorescencia debe leerse mediante un subsistema de detección que, a su vez, informa al usuario.
En la situación ideal, el detector podría implantarse con la proteína inmovilizada y consultarse por radiofrecuencia, sin embargo, actualmente esto solo se ha logrado con sensores amperométricos. El enfoque general para los sensores fluorescentes es unir la proteína a un extremo de una fibra óptica implantada debajo de la piel, mientras que el otro extremo está conectado al subsistema de detección, que incluye un divisor de ruta (fibra cortada o espejo dicroico) para permitir la fibra para transmitir tanto la excitación como la luz emitida, una fuente de luz filtrada (en general, un láser) y un fotodetector filtrado (un CCD o un PMT).
La información así recopilada se analiza luego con una computadora.
Tatuaje inteligente
La piel es permeable a la luz infrarroja cercana (NIR). Como consecuencia, los colorantes del infrarrojo cercano se pueden medir a través de la piel sin necesidad de una fibra óptica; McShane, quien creó un ensayo de extinción de oxígeno en el infrarrojo cercano contenido en microesferas, lo ha denominado «tatuaje inteligente».
Sin embargo, existe una cantidad limitada de colorantes fluorescentes disponibles en el mercado y una cantidad limitada de colorantes ambientalmente sensibles, como la cianina cy. Como consecuencia, Pitner hizo un colorante rojo Nilo reactivo, pero hasta la fecha no se ha realizado ningún estudio con un sensor Ggbp de rojo Nilo.
Sin embargo, se han realizado varios estudios con colorantes NIR. Pickup y Birch fabricaron un sensor NIR Fret que mide los recuentos resueltos en el tiempo o mediante nanotomografía de aloficocianina-ConA/verde de malaquita-Dextrano, donde la aloficocianina es una proteína fluorescente NIR. En otro estudio, la autofluorescencia de NAPH, un portador de energía en las células, se evaluó como un indicador indirecto.
Un grupo de BioTex Inc, dirigido por McNichols y Ballerstadt, creó un sensor NIR Fret basado en ConA, con colorantes NIR Alexa 647 y Alexa 750 (originalmente Alexa 647 y cy) encerrados en una fibra de diálisis unida al extremo de una fibra óptica. que han bautizado como «FAS» (fluorescente). Para mejorar la estabilidad, unieron la proteína a un sephadex, un hidrogel macroporoso.
A pesar del cambio en Fret de solo un 35 % en el rango fisiopatológico (posiblemente un cambio máximo del 40 % desde la ausencia de glucosa hasta la saturación), se ha demostrado que la funcionalidad del sensor disminuye solo un 20 % después de 450 días de incubación a 37 ºC (99 ºC). F) y para monitorizar la glucosa así como el sensor CGMS de Medtronic/Minimed en modelos animales (ratón, cerdo y perro);
Sin embargo, su objetivo declarado es crear un tatuaje inteligente.
Draper Laboratory también está desarrollando un tatuaje inteligente y actualmente está probando en animales. El rendimiento y la identidad del sensor no han sido revelados.
Encapsulación en membranas de diálisis
A pesar del mayor beneficio de los tatuajes inteligentes en comparación con una fibra óptica transdérmica, aún no se ha demostrado ningún tatuaje inteligente in vivo, mientras que los sistemas basados en fibra han demostrado ser sensores potenciales.
La mayoría de los sensores mencionados en las secciones anteriores consistieron en proteínas marcadas en solución. Los únicos sensores que progresaron hacia un sensor implantable han sido sensores de ensayo de extinción de oxígeno GOx-rutenio o sensores de ensayo de competición Fret; hasta la fecha, no se han publicado sensores basados en colorantes sensibles al medio ambiente conectados al final de una fibra.
Para que los biosensores basados en fibra funcionen, la proteína debe inmovilizarse en la fibra que puede quedar atrapada en un tubo hueco hecho de membrana de diálisis o atrapada en un hidrogel.
Un tubo de diálisis hueco es un tubo con un diámetro submilimétrico cuyas paredes están compuestas de celulosa reticulada porosa diseñada para permitir el paso de pequeños solutos, pero no de biomoléculas grandes, como proteínas con un límite de 0,5 a 20 kDa. Como consecuencia, son muy adecuados para aplicaciones sensoriales, donde el analito es libre de difundirse mientras que las proteínas no pueden, tanto la proteína sensora interna como las proteasas de sangre/tejido intersticial.
De hecho, el sensor GlucoDay de Menarini Diagnostics tiene una vida útil mejorada porque la sonda inyectada usa una membrana de diálisis, aunque para aumentar drásticamente la velocidad de difusión, se acopla con una bomba.
Encapsulación en un hidrogel
En cuanto a su aplicación en la detección de glucosa por fluorescencia, el primer biosensor de glucosa por fluorescencia que, como se mencionó, se fabricó en 1982 mediante un ensayo de competencia de Fret para el sitio de unión de ConA, fue atrapado en un tubo de microdiálisis sellado, en el mismo laboratorio, a saber, de J Schultz, en 2001 se publicó otro estudio usando fibras de microdiálisis usando un sensor Fret ConA pero con diferentes etiquetas y usando sephadex en lugar de dextrano (el primero es varios órdenes de magnitud más grande).
Después, el Dr. Ballastardt se unió a BioTex como científico senior bajo el Dr. Roger McNichols, el científico jefe, donde durante los últimos siete años han estado probando el sensor FAS mencionado anteriormente, que usaba el mismo Fretsistema en un tubo de diálisis. Para ser específicos, la proteína marcada se cargó con una punta P10 en un tubo de diálisis de 200 μm de ancho que había sido sellado con cianoacrilato (superpegamento) en un extremo con o sin fibra óptica extremo insertado en el interior.
En el campo de los sensores de analitos, los sensores de glucosa han estado a la vanguardia debido a la gran cantidad de investigaciones sobre sensores de glucosa como resultado de la prevalencia de la diabetes, sin embargo, una amplia gama de biosensores basados en fibra óptica, principalmente utilizando enzimas, inmunoensayos, ácidos nucleicos, células completas o materiales biomiméticos y basándose en diferentes métodos de detección (fluorescencia, absorbancia, quimioluminiscencia y dispersión) y métodos de unión (recubrimiento, hidrogeles o membranas).
Sin embargo, la mayoría de estos sensores se basan en atrapar la proteína en hidrogeles, ya que estos son más resistentes y protegen la proteína más que un simple recubrimiento o membrana. Un hidrogel es una matriz polimérica reticulada porosa llena de agua. Existen varios tipos de hidrogel que se han utilizado para atrapar moléculas pequeñas, como colorantes, biomoléculas, como enzimas o células enteras.En el caso de la proteína, pueden funcionar atrapando físicamente la proteína que tiene poros más pequeños que las proteínas o mediante la unión química de la proteína a la matriz.
En los geles que atrapan físicamente, la proteína debe agregarse cuando el gel se entrecruza, por lo que las condiciones utilizadas no deben dañar la proteína, excluyendo el hidrogel, que requiere solventes no acuosos o productos químicos agresivos, un ejemplo siendo Acrilamida o acrilato catalizado por persulfato TEMED (iniciación de radicales peróxido), que se utiliza para SDS PAGE pero no para la encapsulación de proteínas.
Los hidrogeles se han estudiado ampliamente, principalmente en el atrapamiento de moléculas pequeñas para la administración de fármacos, incluidos los casos en los que las nanopartículas de hidrogel liberan lentamente el fármaco en un sitio específico. Los hidrogeles se pueden clasificar según sus polímeros constituyentes, que pueden ser naturales (hialuronano, ácido algínico, pectina, carragenano, condroitín sulfato, dextrano y sulfato de dextrano, quitosano, polilisina, colágeno, carboximetil quitina, fibrina, agarosa, pululano), o sintéticos.
PEG, PLA, PLGA, PCL, PHB, PVA, PNVP, P(HEMA), p(biscarboxi-fenoxi-fosfazeno), p(GEMA-sulfato) y otros), o un híbrido de los dos. Además de los hidrogeles orgánicos, existen sol-geles, que son silicatos con puente de oxígeno (u óxido de titanio), que polimerizan en agua.Una clasificación adicional puede ser por método de polimerización, que puede ser físico (congelación o calentamiento) o químico (rayos γ, oxígeno o polimerización por radicales fotoinducida en el caso de acrilatos, vinilos y acrilamidas).
Todos los diversos hidrogeles tienen diferentes ventajas y desventajas, como biocompatibilidad, estabilidad de proteínas, toxicidad o vida útil; por ejemplo, las condiciones de gelificación de los sol-geles pueden dañar la proteína y, como resultado, se pueden agregar varios copolímeros, como el quitosano (haciendo geles híbridos) o monómeros alternativos, como el tetraetoxisilano modificado con glicol como es más biocompatible que el tetraetoxisilano modificado con metoxi o etoxi comúnmente usado.
Fibras con hidrogel
En cuanto a los biosensores basados en fibra óptica, se han utilizado varios hidrogeles, pero principalmente polímeros basados en acrilatos y sol-geles, ya sea por atrapamiento químico o físico. En el caso de la acetilcolinesterasa, el objetivo de muchos pesticidas, se han fabricado sensores que unen químicamente la enzima a un hidrogel de acrilato o atrapan físicamente la enzima en solgel.
En el laboratorio de Loeb (Liao y colegas) se fabricó un biosensor de glucosa atrapado en hidrogel basado en fibra óptica y se denominó Sencil. este sensor estaba compuesto por un hidrogel de PEG modificado con diacrilato fotorreticulado que contenía tetra-rodamina (TRITC), betaciclodextrina competidora de Fret marcada y la apoenzima concanavalina A marcada con puntos cuánticos.
La funcionalidad de este sensor se probó solo in vitro; sin embargo, se realizaron algunas pruebas para ver la compatibilidad de la fibra implantada por vía transdérmica en ratones. En particular, se controló la inflamación y se midió la energía necesaria para eliminarla con fuerza, demostrando que la fibra recubierta de colágeno requiere más fuerza que para eliminar un cabello, que tiene el mismo diámetro (200 μl).
Otro sensor basado en fibra se realizó en el laboratorio de Singaram (santa Cruz). Este utilizó un hidrogel de metacrilato de 2-hidroxietilo como andamio sobre el que se adhirieron dos tintes, uno aniónico fluorescente y un extintor catiónico (para ser específicos, un viológeno) funcionalizado con ácido borónico, que asume una carga negativa cuando se une a la glucosa, haciendo la carga neta de la molécula es neutra y menos atraída por el fluoróforo, por lo que modula su intensidad en función de la concentración de glucosa.
La mayoría de los hidrogeles están adheridos a la fibra, con la excepción del sensor basado en fibra óptica fabricado por el grupo de Itsubayashi para medir la glucosa en los peces (indicador de salud), que utilizaba una membrana de diálisis como soporte del hidrogel. Para ser más específicos, se basó en un ensayo de extinción de rutenio y oxígeno GOx en el que la proteína se mezcló con AWP (alcohol polivinílico funcionalizado con azida, un polímero fotorreticulable) y se entrecruzó con una membrana de diálisis que se enrolló alrededor de una sonda de oxígeno de rutenio prefabricada.
Óptica oceánica) y se inserta en una aguja de calibre 18 con ocho agujeros en el costado (similar a una grabadora).En tal configuración, la integridad de la proteína no tiene efecto sobre el sensor, a menos que esté por debajo de cierta concentración. Como consecuencia, la destrucción o inaccesibilidad de una fracción de la proteína no es problemática, lo que contrasta con Fret o la detección ambientalmente sensible.
Sin embargo, la velocidad de respuesta de este sensor es lenta y requiere que se aplique una predicción matemática a la medición.
Un uso alternativo del ácido borónico en hidrogeles se ve en Stokke en Noruega, donde el hinchamiento de un gel de acrilamida funcionalizado con boronato debido al cambio de carga al unirse a la glucosa se mide con un interferómetro Fabry-Pérot en el otro extremo de la fibra (tenga en cuenta que este es un método diferente a la fluorescencia y se basa en la dispersión).
Una excepción al uso de colocar la fibra óptica por vía transdérmica se ve en la fibra mencionada anteriormente del grupo de Ingo Klimant (enfriamiento de rutenio por oxígeno liberado por GOx catalizada por glucosa): el sensor, de hecho, se construyó funcionalizando un sensor de oxígeno prefabricado.
Con glucosa oxidasa e insertarlo en un aparato de detección de glucosa para sensores amperométricos, en particular, un catéter de microdiálisis CMA 60 implantado transdérmicamente y el sensor conectado a su tubo Tygon. Este sensor fue probado en un voluntario humano y mostró resultados a la par con los sistemas amperométricos actuales.El uso de una fibra fue dictado por la predisponibilidad de esta en comparación con una lente recubierta de rutenio, que habría logrado los mismos resultados, por lo que este enfoque debe colocarse en una categoría propia junto con las fibras transdérmicas y los tatuajes inteligentes.
Sin embargo, el objetivo del grupo es crear nanopartículas sensibles a la glucosa para interrogarlas con una fibra óptica transdérmica y controlarlas magnéticamente. Como consecuencia, el grupo está mejorando la sonda de detección de oxígeno mediante la investigación de nuevos materiales fosforescentes sensibles al oxígeno, la formulación de nanopartículas y la creación de nanopartículas magnéticas.
Referencias
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